HIV anticorpo dosaggi, rilevamento HIV.

HIV anticorpo dosaggi, rilevamento HIV.

I test per rilevare anticorpi anti-HIV possono essere ulteriormente classificati come: 1) di screening test, che sono progettati per rilevare tutti gli individui infetti, oppure 2) test di conferma (supplementari) che sono progettati per identificare gli individui che non sono infetti, ma che hanno lo screening reattivo risultati del test. Di conseguenza, i test di screening possedere un elevato grado di sensibilità, mentre test di conferma hanno una elevata specificità. Prove con elevata sensibilità producono pochi risultati falsi negativi, mentre i test con alta specificità producono pochi risultati falsi-positivi. Queste classi di test, eseguiti in tandem, producono risultati che sono altamente preciso, affidabile, e opportuno proteggere l’afflusso di sangue o aiutare nella diagnosi di infezione da HIV. Errori tecnici verificano, tuttavia, e ci sono fattori biologici che possono limitare l’accuratezza del test HIV. Pertanto, con il processo di test, vi è il requisito di un programma di qualità straordinaria e dedicato. (1) Indipendentemente dai risultati, perché i test di laboratorio non sono perfette, sono destinate ad essere un supplemento per la diagnosi clinica.

Early Detection e il periodo finestra

I test per lo screening per infezione da HIV

Considerazioni nella scelta di una metodologia di test di screening

Indipendentemente dal particolare test di screening utilizzato, i campioni di siero o plasma prima sono testati (screening) con un test ad alta sensibilità, il più delle volte un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), "test rapido," o "metodo semplice" (descritto sotto). ELISA è il metodo di screening utilizzato più comunemente, con gli altri 2 metodologie che offrono più risultati rapidi con procedure semplici applicabili per l’utilizzo nei test point-of-care e nei paesi in via di sviluppo. Con l’avvento di nuove terapie per il trattamento dell’infezione da HIV e la raccomandazione di istituire la terapia il più presto possibile (ma non più tardi di 72 ore) dopo l’esposizione, (5) rapidi test può essere la più appropriata per testare il paziente di origine dopo l’esposizione (ad esempio, , ferite provocate da aghi). Più recentemente, i test sono stati sviluppati utilizzando fluidi che possono essere ottenuti convenientemente fuori del laboratorio clinico. Il sangue intero dal polpastrello e fluido orale (saliva) ha dimostrato di essere efficace come siero o plasma per la ricerca degli anticorpi HIV.

Rilevamento di individui in infezione precoce offre diversi vantaggi. Identificare le infezioni nei precedenti 4 mesi facilita il monitoraggio di droghe per via endovenosa e / o contatti sessuali, come solo i contatti in un recente periodo di tempo definito richiedono tracing. Inoltre, perché le alte cariche virali di infezione precoce sono associati ad un aumentato rischio di trasmissione, l’identificazione delle popolazioni ad alta incidenza può aiutare in modo efficace di targeting interventi di prevenzione. Monitoraggio aree di alta incidenza di infezione da HIV ha implicazioni cliniche e terapeutiche per la diagnosi neonatale e per un rapido inizio del trattamento antiretrovirale, e anche in grado di fornire informazioni per la prognosi, identificare le comunità più probabilità di beneficiare di vaccini preventivi, e contribuire alla iscrizione di recente individui infetti negli studi di fisiopatologia e terapia farmacologica.

strategie di laboratorio-based che può distinguere gli individui recentemente infettati da quelli con infezione stabiliti sono stati ideati. In questi metodi, sono state modificate le procedure di analisi ELISA o rapido convenzionali per permettere la discriminazione del titolo di anticorpi o anticorpi avidità. Questi test modificati sono stati chiamati "depotenziato" saggi o "sensibile / meno sensibili" (S / LS) saggi.

Il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo / LS rapido S utilizzando il test Uni-Gold HIV (Trinity Biotech, Wicklow, Irlanda), a 10 minuti, leggere visivamente, test rapido. Questo metodo, basato su una diluizione del siero per la modalità LS, ha dato risultati eccellenti in confronto con il test Abbott 3A11 e quando valutata utilizzando campioni di individui con date sieroconversione noti. Inoltre, abbiamo ottenuto risultati preliminari utilizzando un test della saliva HIV, SalivaCard (Trinity Biotech), che mostra l’utilità come strumento di S / LS (11). Più di recente, abbiamo sviluppato un test semplice e agglutinazione di particelle a basso costo come S / LS test e dimostrato di essere il 97% esatto (osservazione non pubblicata). Il vantaggio di test S / LS rapido e semplice, è che sono portatili e possono essere utilizzati per identificare le popolazioni ad alta incidenza in aree remote dove la strumentazione ELISA non può essere sostenuto. Inoltre, anche nei paesi sviluppati, che possono essere adattati facilmente per l’uso in centri di sperimentazione mobili per identificare gli individui recentemente infetti in modo che possano essere consigliati in modo appropriato per trovare persone di contatto negli ultimi mesi o immediatamente gli individui senza scalo a opportuni centri di trattamento. Infine, la non invasività del test rapido della saliva a base può aumentare la partecipazione di test.

Saggi di quarta generazione per il rilevamento simultaneo di HIV antigene e anticorpo

Quando eseguito correttamente, test HIV rapidi sono accurate e hanno un grande utilità in una serie di situazioni di test. Applicazione include pronto soccorso, studi medici, i test point-of-care, sale autopsia, agenzie di pompe funebri, banche del sangue di piccole dimensioni, e le situazioni che coinvolgono stat test HIV (dove si consiglia un trattamento immediato per esposizioni). test Rapid HIV si sono dimostrati particolarmente utile per testare le donne incinte in travaglio che non hanno ricevuto cure prenatali (vale a dire, di sconosciuto status HIV). E ‘stato dimostrato che l’istituzione della terapia antiretrovirale (ad esempio, zidovudina) è efficace nel ridurre la trasmissione di HIV, e che questo dovrebbe essere fornita prima possibile alla madre e successivamente al neonato. test rapido HIV della madre che si trova nei pressi di consegna permette il trattamento di essere iniziato prima della consegna se un stato sierologico positivo è determinato. (32) È importante sottolineare che questi rapidi test sono facili da eseguire e avere utilità nei paesi in via di sviluppo, dove le strutture potrebbe non essere ottimale , stabile di energia elettrica può essere disponibile, e programmi di educazione formale per laboratoristi sono assenti.

Il 1-passo rapido test più recenti, noto anche come test immunocromatografici, sono utili strumenti, indipendenti per i test sierologici dell’HIV, costituito da un dispositivo di cartucce piatta, di solito in plastica o carta. sangue intero, fluido orale, o siero è posto sulla punta del dispositivo e lasciati diffondere lungo una striscia che è impregnato di reagenti (spesso proteina A oro colloidale) che si legano e permettere rilevazione visiva di anticorpi HIV; alcuni usano la tecnologia (panino antigene) di terza generazione. Questi test possono essere completati in 10 minuti (circa 2 minuti), richiedono poca o nessuna aggiunta di reagenti, e contengono un reagente di controllo della qualità integrato per il controllo di eventuali errori. Alcuni test possono essere memorizzati in un ampio intervallo di temperature (da 15 C a 30 C), e sono trasportati facilmente. Ad esempio, un tipo (Determinare; Abbott) viene in "carte" di 10 prove ciascuna, rendendo possibile effettuare 100 test in una tasca della camicia; le carte non richiedono reagenti, solo aggiunta di siero o plasma. La prova può essere eseguita su sangue intero o sangue raccolto mediante pungidito (questo richiede 1 tampone aggiunta). Questi tipi di test HIV rapidi stanno guadagnando popolarità a causa della loro semplicità, facilità di interpretazione, e robustezza. (33,34) In particolare, il metodo di raccolta dito viene insegnato facilmente a personale sanitario in situazioni di sensibilizzazione o furgoni mobili. L’uso di esemplari pungidito può anche prevenire la raccolta e rigetto di unità complete di sangue donato (dove il sangue viene raccolto prima del test in un laboratorio remoto e tenuto fino a quando i risultati diventano disponibili) inutili. Un’altra varietà di dispositivi di flusso laterali consente l’uso di saliva, plasma, sangue intero o campioni pungidito, aggiungendo così flessibilità nel tipo di campionamento (vedi "Alternative ai test classici e strategie di sperimentazione " sotto).

Altri formati di test rapidi includono aste di livello, in cui l’antigene è attaccato sul "denti" di dispositivi simili a pettini; molti di questi test rapidi hanno la capacità di differenziare HIV-1 e HIV-2. Svantaggi includono un’interpretazione personale, difficoltà di lettura se il laboratorian è colore cieco, e un costo superiore a quello della ELISA. Attualmente, 4 rapido test HIV sono approvati per l’uso negli Stati Uniti.

Questo tipo di test HIV richiede più di 30 minuti per i risultati, ma consiste di procedure che possono essere eseguite facilmente senza strumentazione. All’interno di questa classe di test sono test di agglutinazione in cui sono consentite le particelle antigene rivestite (globuli rossi, particelle di lattice, o particelle di gelatina) per reagire con anticorpi sierici per formare grumi visibile (agglutinazione). Se si utilizzano i globuli rossi, la tecnica è chiamata emoagglutinazione passiva; con l’uso di particelle di lattice, è noto come agglutinazione del lattice. In Asia orientale, un test di agglutinazione gelatina particella dell’HIV è popolare, che offre una buona sensibilità, a basso costo e facilità di prestazioni. E ‘dotato di un sistema di controllo di qualità per rilevare gli anticorpi non specifici diretti verso le particelle di gelatina stessi, ei risultati possono essere ottenuti entro 2 ore con il minimo hands-on tempo. Anche se appropriato per l’utilizzo in impianti con capacità di test limitate, questo test deve essere eseguito in condizioni di temperatura controllata.

Le prove per confermare l’infezione da HIV

Maggior parte degli algoritmi di test richiedono l’uso di test molto specifici, come il Western blot, saggio immunofluorescenza indiretta (IFA), o nel test di radioimmunoprecipitazione (RIPA), per verificare i risultati dei test di screening reattivi. Se eseguita e interpretata correttamente, questi test estremamente specifici non dovrebbero produrre risultati biologici falsi positivi. Essi sono, tuttavia, più laboriosa e più costoso di test di screening.

Western Blot test

Il Western Blot è probabilmente il test di conferma più ampiamente accettata per la rilevazione di anticorpi contro i retrovirus. La maggior parte delle autorità ritengono che il gold standard per la validazione dei risultati da HIV. Si basa sull’utilizzo di una tecnica elettroforetica per separare antigeni di HIV derivati ​​da un lisato di virus cresciuto in coltura. Questa tecnica denatura le componenti virali, impartisce una carica negativa agli antigeni, e li separa principalmente sulla base del loro peso molecolare. La separazione di antigeni nella tecnica consente l’individuazione di anticorpi specifici per ciascuno degli antigeni virali in una successiva serie di misure analoghe alla metodologia ELISA.

Interpretazione dei risultati

Alcuni individui che presentano risultati indeterminati (ad esempio, la reattività di p24 e p55) in seguito seroconvert, dimostrando che un p24 e p55 profilo può indicare infezione precoce. Al contrario, altri individui possono avere il profilo identico per lunghi periodi di tempo (anni) e mai sieroconversione (cioè, non sono infettati). In realtà, la maggior parte indeterminati risultati Western Blot da persone non infette presentano il p24 e / o profilo p55. Pertanto, un risultato Western Blot indeterminato non può prevedere l’infezione precoce.

La maggior parte delle autorità suggeriscono che le persone con risultati indeterminati dovrebbero essere ritestati dopo diversi mesi, anche se la sieroconversione può essere rilevato in un periodo di tempo più breve. Se possibile, la rianalisi di un individuo in un momento successivo deve essere eseguito in parallelo con questa nuova analisi del campione iniziale sul medesimo percorso con gli stessi numeri di lotto e le stesse condizioni del saggio per garantire che i campioni possono essere confrontati direttamente. L’OMS raccomanda di ripetere il test persone dopo 2 settimane, se sono prodotti di grande suggestione profili Western Blot, anche se altre organizzazioni suggeriscono di aspettare 1-6 mesi prima di ripetere il test. Se un individuo viene rianalizzato in un periodo di 6 mesi e diventa negativo o profili banda non progrediscono, infezione da HIV in generale si può escludere. Per motivi poco conosciuti, molte persone continuano a mostrare risultati indeterminati per anni, ma non sono infetti. Se un individuo non progredisce sierologicamente (più bande o maggiore intensità delle bande) o converte in positivo (sieroconversione) durante ripetere il test, l’individuo probabilmente è stato infettato al momento della prima prova (infezione precoce). Va notato che gli individui che hanno ricevuto la vaccinazione per l’HIV (ad esempio, gp160 subunità) possono essere erroneamente identificati come positivi basato su reazioni a soli antigeni busta.

HIV-2 è endemica soprattutto nelle aree dell’Africa occidentale, ma l’aumento della prevalenza e la distribuzione di HIV-2 infezioni rende necessario l’uso di test in grado di rilevare l’infezione da HIV-2. Negli Stati Uniti, circa 80 casi di HIV-2 sono stati verificati, la maggior parte dei quali sono stati collegati in Africa occidentale. Biologicamente, HIV-2 è molto simile a HIV-1: il genoma HIV-2 presenta circa il 60% di omologia nel più conservata bavaglio e pol geni, e da 30 a 40% di omologia in altri geni virali e sequenze long terminal repeat (LTR). Gli antigeni di HIV-2 sono simili a quelli del virus HIV-1, ma i pesi molecolari possono variare leggermente. Per esempio: le proteine ​​Gag di HIV-2 hanno denominazioni di P56, P26, P16 e; la Pol proteine ​​P68 e P34; e il glicoproteine ​​busta gp36 (o gp41), gp140, e GP105. Come con l’HIV-1 test di screening, una varietà di formati di prova sono a disposizione per rilevare gli anticorpi per HIV-2, comprese le perle ELISA, ELISA microtitolazione, e saggi rapidi / semplici.

Per risolvere questo problema, disponibile in commercio HIV-1/2 "test di combinazione," che incorporano antigeni da entrambi i virus, può essere utilizzato per schermo sieri nel tentativo di identificare o infezione. La successiva differenziazione delle infezioni da HIV-1 e HIV-2 richiede l’uso di altamente specifico ELISA (ad esempio, sintetico peptide-based), Western Blot, saggi di radio-immunoprecipitazione, o PCR.

HIV-2 test di conferma sono il Western Blot e la RIPA. Inoltre, i test EIA e alcuni test rapidi che utilizzano i peptidi sintetizzati chimicamente corrispondenti ad una regione immunogenico unica all’interno delle rispettive glicoproteine ​​transmembrana mostrano una buona correlazione con il Western Blot e il RIPA per identificare e differenziare HIV-1 e HIV-2 anticorpi. Inoltre, questi test sono utili per differenziare i campioni che producono reazioni a entrambi i virus (dual reattori).

Alternative ai test classici e strategie di sperimentazione

Come la tecnologia si evolve, si presentano alternative ai test classici e strategie di sperimentazione. Ogni offre 1 o più attraenti caratteristiche che possono semplificare raccolta, il controllo, o l’interpretazione dei risultati.

Saliva Test (saliva) HIV

campioni raccolti in maniera non invasiva, come fluidi orali, sono stati utilizzati per il test HIV come comoda alternativa ai campioni di sangue. Anche se generalmente denominato "saliva," il fluido utilizzato per il test è in realtà fluido crevicolare dai capillari sotto il margine del dente-gum, che è un trasudato di sangue e quindi simili ai campioni usati in test siero-based. La concentrazione di anticorpi nella saliva è circa 1/400 di quella del plasma, tuttavia, a causa dell’effetto diluizione di fluidi dalle ghiandole salivari (true saliva), (36) e richiedente prove estremamente sensibili che sono in grado di rivelare piccole quantità di anticorpo. La tecnologia di prova per rilevare questi basse quantità è ora disponibile, e le prove di saliva, sia ELISA e test rapidi, sono accurate. (37,38)

Una revisione completa di test fluido orale per HIV è stato pubblicato. (36) L’uso di fluidi orali per i test offre vantaggi quali la facilità di raccolta, collezioni di gruppo, raccolta da persone in cui il sangue è difficile da ottenere, e un aumento collezione aderenza. (1,36)

Le strategie alternativi di verifica ricorrendo test di screening

Un altro recente anticipo che fa uso della tecnologia precedente, ma in un formato romanzo, comprende rapido test di conferma che incorpora diversi antigeni diversi HIV 1 dispositivo per il test rapido (simile a combinazione HIV-1 e HIV-2 test rapidi). Questi rapidi, test a flusso continuo sono eseguite in modo identico ad un rapido test di screening (aggiunta di diversi reagenti in modo goccia a goccia) e producono "profili di reazione" simili a quelli del test Western blot e LIA. Una valutazione approfondita di uno di questi test di conferma rapidi ha prodotto ottimi risultati. (40) Diverse aziende stanno introducendo questi test di affrontare la questione di costosi ed ingombranti Western Blot test di conferma e la necessità associata per significative infrastrutture di laboratorio.

HIV diagnostica dilemmi

Le maggiori difficoltà con la diagnosi di laboratorio delle infezioni da HIV sono: 1) indeterminati risultati Western Blot; 2) minimamente reattivi conferma i risultati dei test da parte di individui non infetti; 3) risultati incoerenti quando si ripetono i campioni o analisi di campioni di follow-up; 4) il verificarsi di errori tecnici; 5) risultati falsi negativi derivanti da virus HIV Gruppo O; e 6) la diagnosi di laboratorio di infezione da HIV nel neonato.

Indeterminati Risultati Western Blot

Errori tecnici si verificano, e anche se non possono essere eliminati del tutto, possono essere minimizzati attraverso l’istituzione di un programma di garanzia di qualità completo e le misure preventive documentati. errori materiali sono i più comuni, e possono essere affrontati in modo efficace attraverso un meccanismo di controllo prudenziale dedicato. Diverse misure di garanzia della qualità essenziali sono descritti in seguito.

Risultati falsi negativi per l’HIV Gruppo O

La diagnosi nel neonato

La diagnosi di laboratorio del virus HIV nel neonato è stato difficile fin dai primi test sono stati sviluppati, principalmente a causa della onnipresenza di anticorpi materni entro 1 anno dopo la nascita, momento in cui il bambino può serorevert. Successivamente, può essere più diversi mesi fino a quando il sistema immunitario del bambino infetto è abbastanza competente per la produzione di anticorpi (sieroconversione). test antigene può essere di aiuto, così come la PCR, per rilevare l’HIV DNA o RNA nel neonato. Attualmente, tuttavia, diagnosi definitiva nel neonato è ancora difficile, specialmente prima di 6 mesi di età.

Il monitoraggio del processo di testing: Quality Assurance, controllo di qualità e valutazione della qualità

La validità dei risultati dei test diagnostici dipende dalla qualità di una serie di misure usato prima, durante e dopo l’esecuzione del test. (1) Al fine di garantire la qualità dei risultati dei test, un programma composto di controllo della qualità, controllo di qualità, e la qualità valutazione è necessaria. Nei paesi più sviluppati, agenzie di regolamentazione forniscono le linee guida per un programma del genere. Al contrario, i programmi formali e raccomandazioni in generale non sono disponibili nei paesi in via di sviluppo. Brevi descrizioni ed esempi di programmi di garanzia della qualità seguono.

Garanzia di qualità comprende tutte le misure, dal ricevimento di esemplari attraverso rendicontazione finale, per garantire che i risultati finali sono precisi come i saggi consentono. I campioni devono essere ispezionati all’arrivo di idoneità; la registrazione, l’elaborazione e la revisione di tutti i documenti di accompagnamento devono essere eseguiti e monitorati attentamente. Inoltre, sono un sistema di tenuta dei registri organizzato, standard di manuali di procedura operativa che fungono da riferimenti, un programma di formazione continua, di controllo prudenziale dei risultati, un sistema di valutazione del personale di laboratorio, l’uso dei più appropriati test / strategie, un meccanismo per la comunicazione tempestiva , la conformità con i requisiti normativi, conservazione dei campioni per i test di follow-up, adeguate forme di comunicazione, varianza reporting per errori / incongruenze, un buon sistema di gestione, e, naturalmente, un buon controllo di qualità e valutazione della qualità dei programmi.

Riferimenti

Costantino NT, Saville, RD, Dax, EM. Retrovirale Test e Quality Assurance: Elementi essenziali per Laboratorio diagnosi. Ann Arbor, MI: Stampanti Malloy; Del 2005.

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